1. Механизм образования отрицательного давления внутри флаконов с образцами

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) все чаще применяются методы крупнообъемной инъекции (LVI) для удовлетворения растущих потребностей в высокочувствительном обнаружении и анализе следов мельчайших образцов. Однако, когда на один объем инъекции приходится высокая доля эффективного объема свободного пространства, такого как инъекция от 100 мкл до 500 мкл из образца объемом 2 мл, часто встречаются явления, подобные ухудшенной повторяемости и аномально уменьшенным пиковым областям. Основная причина часто кроется в немалом отрицательном давлении, создаваемом внутри флакона для образца в процессе отбора проб.

В данной статье анализируются механизмы образования отрицательного давления во флаконах для проб емкостью 2 мл с точки зрения гидродинамики и физико-химических аспектов, оценивается его влияние на аналитические результаты, а также приводятся систематические профилактические меры и оперативные рекомендации.

1. Механизм образования отрицательного давления внутри флаконов с образцами

В закрытой системе общее внутреннее давление флакона с образцом емкостью 2 мл состоит из парциального давления остальных газов и давления насыщенных паров растворителя:

Когда игла автосамплера прокалывает перегородку для взятия образца, равновесие системы нарушается Процесс генерации отрицательного давления включает в себя следующие физико-химические механизмы:

1.1 Смещение объема и внезапное падение давления, вызванное аспирацией жидкости

Согласно закону идеального газа () при постоянной температуре и молярном количестве газа давление газа обратно пропорционально объему.

• Когда стандартный флакон с образцом емкостью 2 мл заполнен 1,5 мл образца, начальный объем свободного пространства составляет примерно 0,5 мл (500 мкл).
• Когда игла сразу втягивает объем инъекции, предполагая полностью герметичную перегородку без внешнего пополнения газа, объем свободного пространства мгновенно расширяется до.
• Без учета пополнения паров давление газа в свободном пространстве падает примерно до 71,4% от его первоначального значения, создавая отрицательный перепад давления около 28,6 кПа (0,286 бар) внутри флакона. Большие объемы впрыска приводят к большим относительным изменениям объема свободного пространства и более выраженному отрицательному давлению.

1.2 Давление паров растворителя и фазовое равновесие Лаг

После отбора жидкости система имеет тенденцию пополнять давление свободного пространства за счет испарения растворителя. Однако скорость испарения из жидкой фазы в газовую ограничена коэффициентами диффузии и площадью поверхности, что делает невозможным достижение нового газожидкостного равновесия в течение короткого периода времени аспирации иглы (обычно несколько секунд).

• Для растворителей с низким давлением пара (например, воды, смесей ацетонитрила/воды) пополнение давления посредством испарения является крайне слабым, что приводит к длительной продолжительности отрицательного давления.
• Для легколетучих растворителей с высоким давлением паров (например, дихлорметан, метанол), хотя пополнение паров происходит быстрее, быстрое испарение поглощает тепло, вызывая локальное охлаждение.

1.3 Изменения температуры и тепловое расширение/сжатие газов

Согласно закону Чарльза, давление газа прямо пропорционально абсолютной термодинамической температуре Если проба взята непосредственно из низкотемпературной среды (например, из лотка для проб 4°С) или подвергается колебаниям температуры во время отбора проб, изменение температуры напрямую влияет на внутреннее давление во флаконе:

Когда образец остывает, сжатие газа и конденсация пара дополнительно усугубляют эффект отрицательного давления, вызванный аспирацией жидкости.

1.4 Эластичность и характеристики герметизации перегородки

Высокоэластичные перегородки (такие как чистые силиконовые или ПТФЭ/силиконовые композиты) образуют плотное динамическое уплотнение вокруг отверстия иглы при проколе из-за упругой деформации полимерных материалов. Хотя эта превосходная способность к самоуплотнению предотвращает испарение растворителя, она полностью изолирует внутреннюю часть от внешнего входа воздуха, предотвращая выравнивание отрицательного давления, создаваемого аспирацией.

2. Влияние отрицательного давления на результаты хроматографического анализа

Образующееся внутри флакона с пробой отрицательное давление непосредственно нарушает баланс давления жидкостной системы автосамплера, вызывая ряд аналитических расхождений

2.1 Неточный объем инъекции и плохая повторяемость (увеличение RSD)

Точность дозирования автопробоотборников (таких как системы дозирующего насоса/петли образца) опирается на предпосылку, что внутреннее давление флакона с образцом равно атмосферному давлению Когда отрицательное давление существует внутри флакона, сопротивление против плунжера дозирующего насоса во время обратного отвода увеличивается Если мощность всасывания насоса недостаточна для преодоления “гидростатическое давление головки + внутреннее отрицательное давление”, фактический объем, втянутый в петлю образца, упадет ниже заданного значения Это непосредственно вызывает снижение реакции пиковой площади и значительно ухудшает повторяемость (относительное стандартное отклонение, RSD) среди параллельных образцов.

2.2 Дегазация растворителей и образование пузырьков

Согласно закону Генри, растворимость газа в жидкости прямо пропорциональна парциальному давлению этого газа над поверхностью жидкости. Отрицательное давление внутри флакона приводит к тому, что растворенный воздух (в первую очередь азот и кислород) в растворителе образца пересыщается и выделяется газ, образуя микропузырьки.

• Если микропузырьки попадают в петлю образца вместе с образцом, они вытесняют объем жидкости, что приводит к пропуску объема инъекции.
• Если микропузырьки попадают в подвижный фазовый путь потока, они могут вызвать колебания давления в колонке или повышенный базовый шум детектора.

2.3 Селективное воздействие на испарение и концентрацию пробы

Отрицательное давление понижает общее давление над поверхностью жидкости, ускоряя испарение легкокипящих летучих компонентов в свободное пространство.Для образцов, содержащих летучие органические соединения (ЛОС) или низкокипящие растворители, длительное воздействие отрицательного давления приводит к концентрации матрицы или сдвигам соотношений компонентов, ухудшая качественную и количественную точность.

3. Стратегии предотвращения и контроля отрицательного давления при инъекциях большого объема

Чтобы поддерживать стабильность внутреннего давления во время инъекций большого объема, необходимо реализовать оптимизацию выбора перегородки, механического момента уплотнения и контроля температуры.

3.1 Применение предварительно щелевых септ

Для инъекций большого объема,предщелевая перегородкапредложите самое прямое и эффективное физическое решение.

• Механизм: Перегородка имеет предварительно вырезанный однощелевой или поперечнощелевой (звездообразования) микроразрез, введенный во время производства. когда инъекционная игла прокалывает и втягивает жидкость, микрощель слегка открывается под перепадом давления, позволяя небольшому количеству воздуха сбалансировать внутреннее давление. При извлечении иглы перегородка закрывается за счет эластичности материала, предотвращая существенное испарение растворителя.
• Рекомендации: Для инъекций большого объема (> 100 мкл) или непрерывного многократного отбора проб,межщелевые перегородки из ПТФЭ/силиконаследует расставить приоритеты.

3.2 Оптимизация материалов перегородки

Твердость, эластичность и скорость восстановления различных материалов существенно влияют на образование и сброс отрицательного давления.

• Контроль твердости по Шору А: Выберите мягкий силикон с твердостью45° い50° Берег Акак сердцевина эластомерный слой. более низкая твердость уменьшает чрезмерно плотное закрытие отверстия иглы, позволяя ультра-следить микро-вентиляции для облегчения сильного отрицательного давления.
• Толщина слоя ПТФЭ: Толщина пленки ПТФЭ должна контролироваться между ними0,05 — 0,10 мм (0,05 . Чрезмерно толстый слой ПТФЭ увеличивает сопротивление проникновению и исключает необходимую микропроницаемость.

3.3 Контроль крутящего момента затягивания крышки флакона

Чрезмерное затягивание завинчивающихся крышек вызывает сильную деформацию и сжатие перегородки. Это не только увеличивает сопротивление проникновению иглы, но и герметизирует микроскопические воздушные каналы между полимерными цепями, создавая отрицательное давление.

• Рекомендуемый крутящий момент: При использовании завинчивающихся крышек рекомендуемый крутящий момент следует контролировать на уровне0,25 — 0,35 Н·м.
• Стандарт оценки: После укупорки перегородка должна оставаться плоской без визуально заметной выпуклости вниз или деформации сводообразования вверх. Для обжима верхних флаконов используйте калиброванный обжимной станок, чтобы обеспечить гладкие и однородные края алюминиевых крышек без вращения перегородки.

3.4 Стратегия температурного равновесия

Избегайте взятия охлажденных проб (например, 4°С) непосредственно для немедленного заполнения флаконов и инъекции большого объема.

• Время предварительного уравновешивания: После наполнения флаконы с образцами следует предварительно уравновесить в лотке для автопробоотборника (или отделении для проб с контролируемой температурой), по крайней мере, в течение 1000 г15 — 20 минутчтобы достичь заданной температуры перед началом последовательности.
• Поддоны с регулируемой температурой: Если автосамплер имеет контроль температуры, поддержание постоянной температуры лотка (например, 15°С или 25°С) исключает аддитивное отрицательное давление, вызванное охлаждением.

4. Сравнение производительности типов септ при сценариях отрицательного давления

Ниже кратко изложено сравнение физических свойств и пригодности обычных материалов лабораторных перегородок при крупнообъемных инъекциях и сценариях отрицательного давления

Сопутствующие ресурсы с сайта hplcvials.com:

• Продукт: 9 мм Короткие резьбовые винтовые крышки и септа, предварительно разрезанные, скрепленные, и изготовленные из ПТФЭ/силикона
• Руководство: Крышка флакона с предварительной щелью и твердая крышка: что лучше для вашей лаборатории?
• Руководство: Как правильно выбрать флакон для ВЭЖХ Septa для образцов
• Руководство: Насколько выдерживает внутреннее и внешнее давление флаконы для ВЭЖХ?

Сравнительные выводы:

1. Септа из ПТФЭ/красной резиныпроявляют высокую твердость и плохое упругое восстановление. хотя они менее склонны к экстремальному накоплению отрицательного давления при многократных проколах (из-за неполного закрытия отверстий), их высокое содержание выщелачиваемых веществ и плохая химическая стойкость не соответствуют высокоточным аналитическим стандартам.
2. Чистый силиконовый септачрезвычайно мягкие с превосходной способностью к самозапечатыванию, что приводит к наиболее сильному накоплению отрицательного давления. Они также склонны к набуханию в органических растворителях и не рекомендуются для LVI.
3. ПТФЭ/силикон (предварительно щелевой) Septaсочетайте высокую химическую инертность с надежными возможностями выравнивания давления, представляющими собойоптимальное техническое решениедля решения проблем отрицательного давления при крупнообъемном впрыске.

5. Практические руководящие принципы работы и общие подводные камни

5.1 Стандартные операционные процедуры (СОП) для лабораторий

1. Предельное максимальное соотношение объемов инъекций: Для флакона с образцом емкостью 2 мл (стандартный объем наполнения 1,5 мл) в идеале следует сохранять объем для однократной инъекции≤100 мкл. Если инъекции200 — 500 мклобязательны,предварительно щелевые перегородки из ПТФЭ/силиконанеобходимо использовать.

2. Контрольный флакон Объем заполнения образца: Внутри флакона необходимо поддерживать достаточное свободное пространство. Фактический объем наполнения флакона емкостью 2 мл никогда не должен превышать1,5 мл(поддержание не менее 0,5 (0,8 мл свободного пространства). Большее начальное свободное пространство смягчает коэффициенты изменения объема во время аспирации, демпфируя величину перепада давления.

3. Установите разумную скорость жеребьевки: Понизить скорость вытяжки автосамплера в системе хроматографических данных (CDS). Например, снизьте скорость по умолчанию с 10 мкл/с до2 — мкл/с. Более низкая скорость вытяжки дает испарению растворителя дополнительное время для восполнения давления воздуха, снижая пиковое мгновенное отрицательное давление.

4. Калибровать глубину проникновения иглы: Обеспечьте правильную глубину проникновения иглы. Избегайте размещения иглы слишком глубоко там, где она опускается вниз, на пол флакона, что вызывает явление всасывания псевдо-высокого отрицательного давления” из-за закупорки кончика.

5.2 Обычное устранение неполадок при подводных камнях

• Подводное отверстие 1: чрезмерно затягивающие крышки для предотвращения испарения растворителя

• Факт: Чрезмерный крутящий момент серьезно искажает перегородку, что приводит к образованию сердцевины/выпадению сердцевины, которая закупоривает иглу, блокируя уплотнение, так что отрицательное давление невозможно снять.

• Подводное положение 2: прокол неразрезанных перегородки вручную иглой шприца в качестве замены

• Факт: Нерегулярные ручные проколы легко рвутся по краям, вызывая быстрое испарение растворителя досуха. Полученные частицы силикона могут легко засорить колонки ВЭЖХ и клапаны для инъекций; такая практика должна быть строго запрещена.

• Подводный камень 3: предполагая, что области более низких пиков в LVI возникают исключительно из-за утечек в петле образца

• Факт: Прежде чем исключить утечки оборудования, сначала следует проверить отрицательное давление флакона. Ослабьте крышку флакона с образцом на полоборота и введите повторно. Если области пика вернутся в норму, проблему можно диагностировать как отрицательное давление флакона с образцом.